发布日期：2025-05-23 15:55 点击次数：119
为了排除运动对 体内钙成像的影响，通常需要固定动物。然而，全身约束会给动物带来压力，影响实验结果。此外，一些大脑区域在手术过程中容易出血，这降低了钙成像的成功率。在这里，我们提出了一种在头部固定小鼠中使用肝素处理的纤维进行钙成像的方案。我们描述了立体定位手术的步骤，包括病毒注射和光纤植入、光纤光度测定和数据分析。
东莞富临医疗科技有限公司是Miniscope专家，我们为中国客户提供：Miniscope 微型荧光显微镜产品与解决方案。
一、引言
纤维光度法是一种通过植入大脑的光纤记录神经元群体的遗传编码钙荧光信号的方法。该方法结合光遗传学或化学遗传学，对于解码神经回路的连接和功能至关重要。然而，许多脑区在手术过程中容易出血，这降低了钙成像的成功率，并限制了这种方法的广泛应用。此外，运动会影响钙信号的记录，大多数实验室使用身体固定来获取清晰的钙信号，但身体固定通常会在动物中引起强烈的应激反应，从而影响实验结果。因此，这里我们报告了改进的实验方法，可以很好地避免这些缺点。我们采用转盘式头部固定装置对小鼠进行钙成像。这种装置允许动物自由行走或奔跑，但动物的头部位置保持稳定，便于精确定位和测量特定脑区的钙信号活动，并且有可能进行长期记录。此外，这种方法确保了动物在记录期间保持稳定的位置，使得实验者可以轻松地对动物施加不同的手动刺激，并标记刺激的时间戳。与身体固定相比，我们的头部固定方法可能提供更好的实验可重复性，这对于统计分析和数据可靠性是有优势的。此外，尽管本协议专注于纤维光度法记录，但我们已成功将该方法应用于使用Miniscope钙记录系统记录LDT中的单个细胞，表明该方法在研究神经元活动动态方面的多功能性。
展开剩余87%为了进行头部固定的纤维光度法钙成像，以下设备或仪器是必要的，包括立体定位仪、微量注射泵、5微升注射器、头部固定器和外科工具（图1A-D）。本协议主要在小鼠上进行，大鼠的操作需要根据实际情况进行调整。
图 1.手术器械（A） 主要设备包括立体定位仪、微型输液泵、玻璃移液器支架、牙钻、注射器和手术显微镜。（B） 5 μL 注射器需要预装矿物油，然后连接到 PTFE 管上。（C） 手术辅助工具。（D） 头部固定片。
二、实验前准备
2.1 试剂准备
时间：约10分钟
1. 1% 戊巴比妥钠溶液**：将0.5克戊巴比妥钠溶解在50毫升灭菌PBS中（也可以使用其他麻醉剂，如氯胺酮或异氟醚）。
2. 腺相关病毒（AAV）准备：从-80°C取出所需的病毒（以AAV5-pAAV.CAG.Flex.GCaMP6m.WPRE.SV40为例，提前分装2微升/管），在冰上解冻，并在需要时用含有5%甘油的PBS稀释（最终滴度约为每毫升10^12基因组拷贝）。
注意：a. 避免重复冻融病毒，可能会影响病毒感染效率。b. 使用涡旋混合器混合病毒后再使用。
3. 肝素钠溶液准备：将89.2毫克肝素钠溶解在100毫升灭菌水中。
注意：a. 最终肝素钠的抗凝活性为12488 IU（肝素钠通常以国际单位表示，我们使用的肝素钠活性为140 IU/mg）。b. 使用肝素钠预处理光纤，以防止光纤尖端在插入深脑区时被凝血堵塞，从而确保成功接收钙信号。
2.2 仪器准备
时间：约10-20分钟
4.手术工具和手术台消毒：用75%乙醇消毒手术工具和手术台。
注意：手术工具包括针持、镊子和手术剪。
5.拉制玻璃毛细管：使用微毛细管拉力器拉伸玻璃毛细管。
注意：确保毛细管尖端开口直径约为8-10微米。
6. 填充聚四氟乙烯（PTFE）管和玻璃毛细管：用矿物油填充PTFE管（外径：1.0毫米；内径：0.6毫米）和玻璃毛细管。
注意：避免毛细管内出现气泡。
7. 连接注射器和毛细管：将5微升注射器连接到注射泵上，并用PTFE管（直径0.6毫米和1毫米）将玻璃毛细管连接到注射器（图2A）。
图 2.主要外科手术（A） 固定玻璃移液器在支架上。（B） 消毒皮肤并暴露手术窗。（c） 前囟和 Lambda 的定位。（D） 在颅骨表面钻孔，包括将病毒注射到大脑区域和放置螺钉。（E） 提取病毒。（F） 病毒输注。（G） 纤维植入。（H） 固定光纤和头部固定板。
三、动物准备
3.1 动物麻醉
时间：约5-8分钟
8. 麻醉成年（约8周）Vgat-Cre小鼠：使用100毫克/千克戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉。
注意：雄性和雌性小鼠均可用于本协议。
9. 修剪头部毛发并固定小鼠：修剪头部毛发，并将小鼠固定在立体定位仪上。
10. 保护小鼠眼睛：涂抹红霉素眼膏以防止小鼠眼睛干燥。
四、手术窗口
4.1 找到目标脑区并注射病毒
时间：约5-8分钟
11. 消毒皮肤并暴露手术窗口：用碘伏消毒头部皮肤，然后切开头皮以暴露颅骨（图2B）。
注意：如果出血，使用止血棉按压止血。
12. 去除筋膜：使用棉签擦拭颅骨以清晰显示Bregma和Lambda（图2C）。
注意：a. Bregma位于颅骨上冠状缝和矢状缝的交点处。b. Lambda位于矢状缝和人字缝延长切线的交点处。
13. 设置Bregma或Lambda的坐标为原点坐标（AP, 0.00毫米；ML, 0.00毫米；DV, 0.00毫米）。
注意：a. 测量Bregma和Lambda之间的距离（成年小鼠的平均距离约为4.20毫米）。b. 如果距离短于4.00毫米或长于4.30毫米，请重新检查Bregma和Lambda的坐标。c. 确保Bregma和Lambda的垂直位置基本在同一水平面上，差异小于0.10毫米。d. 缩写：AP，从前到后；ML，从内到外；DV，从背到腹。
14. 从小鼠脑图谱（《小鼠脑立体定位图谱》，第二版）中读取LDT的坐标（AP, -5.20毫米；ML, +0.3毫米；DV: -3.50毫米）。
注意：a. 根据坐标找到LDT的位置。b. 使用牙科钻小心地在颅骨上钻一个小孔（约0.5毫米）。
15. 在其他位置钻4个额外的小孔用于螺丝固定（图2D）。
注意：这些小孔的直径应小于颅骨螺丝（直径，0.8毫米；长度，2.0毫米），以确保紧密贴合，有效粘附。
五、病毒加载和注入LDT
5.1 病毒加载和注入
时间：约15分钟
16. 将AAV5-pAAV.CAG.Flex.GCaMP6m.WPRE.SV40病毒放在Parafilm上。
17. 小心地用玻璃毛细管吸取足够的病毒（图2E）。
注意：避免毛细管内出现气泡。
18. 将玻璃毛细管移动到Bregma处，并小心地让其接触颅骨。
19. 将AP、ML和DV坐标重置为0.00毫米。
20. 然后将玻璃毛细管移动到孔的中心。
注意：再次检查坐标读数是否与您感兴趣的脑区的坐标读数匹配。
21. 穿透硬脑膜并缓慢移动玻璃毛细管到目标区域（LDT: AP, -5.20毫米；ML, +0.30毫米；DV, -3.50毫米）。
22. 以100纳升/分钟的速率将200纳升病毒注入LDT（图2F）。
23. 缓慢抽出玻璃毛细管。
注意：a. 病毒解冻后，如有需要，用含有5%甘油的PBS稀释，并在注射前使用涡旋混合器混合病毒。b. 在病毒注射过程中，用生理盐水湿润颅骨，以保持大脑表面湿润。c. 注射后让玻璃毛细管在原位停留10分钟，以确保病毒更好地扩散。d. 缓慢抽出玻璃毛细管，以避免病毒沿注射轨迹扩散。e. 在开始注入病毒之前，在玻璃毛细管上用记号笔做一个标记，以确保病毒注入LDT，通过观察病毒液面是否下降来确认。如果液面没有变化，则需要将玻璃毛细管从大脑中抽出，用0.1 M PBS或生理盐水清洁其尖端，然后再次进行注射或更换新的毛细管。
六、光纤植入和固定不锈钢头部固定片
6.1 光纤植入和固定
时间：约10-15分钟
24. 将光纤的陶瓷插头（光纤核心：Φ400微米，NA：0.37，长度：5.0毫米）放入光纤夹持器中。
25.将光纤移动到Bregma处的颅骨上，并将DV坐标设置为0毫米。
26. 将光纤移动到LDT孔处，并缓慢（100-150微米/分钟）移动到LDT（AP, -5.20毫米；ML, +0.3毫米；DV, -3.30毫米）（图2G）。
关键：光纤在使用前需要用肝素钠处理。为了便于操作，将整个光纤浸泡在肝素钠溶液中5-10分钟；取出光纤，用灭菌棉或纸巾去除光纤上的多余肝素钠液体（无需使用干燥箱烘干光纤）。这一步对于在深部易出血脑区进行荧光成像（如Ca²⁺成像）非常有用，可以大大提高手术的成功率。
27. 用螺丝刀将螺丝固定在颅骨上。
注意：a. 在颅骨上涂一层强力胶水（覆盖螺丝）。b. 喷涂少量树脂（甲基丙烯酸甲酯）以加速强力胶水干燥。
28. 将不锈钢头部固定片（长度，46.0毫米；宽度，5.0毫米；重量，0.4克）放在颅骨上，并用牙科水泥将光纤一起固定（图2H）。
29. 将动物放在加热垫上，直到它们从麻醉中恢复。
注意：a. 将动物放回它们的家笼。b. 每天通过观察运动、食物/水摄入量以及手术前后的体重来监测动物的术后恢复情况。c. 没有从麻醉中恢复、表现出异常发育或感染迹象的动物将通过二氧化碳过量吸入进行安乐死。d. 给予病毒表达3-4周，然后进行光度法记录。
关键：将光纤植入深部易出血脑区（如VTA、LDT、PBN等）通常会导致小鼠恢复缓慢甚至死亡。小鼠的术后护理至关重要，以确保它们的健康和恢复：（1）小鼠应每天通过观察运动、食物/水摄入量以及手术前后的体重进行监测（5-7天）。(2) 疼痛管理对于最小化手术后的不适和痛苦至关重要。在手术前和手术后12小时，给动物注射卡洛芬（5毫克/千克，皮下注射）。(3) 确保小鼠在术后能够获得水和适当的食物，以保持水分和充足的营养。对于较弱的小鼠，建议制作一些湿食，并将其放入它们的家笼中。(4) 为动物提供一个安静、温暖、清洁的恢复环境。
七、纤维光度法和行为
7.1 纤维光度法和行为测试
时间：约60分钟
30. 将小鼠放在转盘上（图3A；头部固定转盘可从Inper LLC获得），并让其适应转盘约30分钟。
图3.在头部固定的小鼠中记录LDTGABA神经元的钙活动(A) 转盘装置（上：示意图；下：转盘图片）。① 平头不锈钢沉头螺钉（3毫米）；② 头部固定片；③ 头部固定片夹持器；④ 支持夹；⑤ 不锈钢杆；⑥ 转盘；⑦ 滑环；⑧ 不锈钢防震支架；⑨ 实心钢面包板。(B) 应用不同厌恶刺激的范式。(C-F) 头部固定小鼠对80分贝白噪声、空气喷射、背部刷拭和电击的LDTGABA神经元反应。左：dF/F的平均值。右：来自样本小鼠的dF/F热图。(G) 同一只小鼠自由运动（左）或头部固定（右）时的原始记录痕迹。箭头指出了运动噪声信号（405纳米信号）。
31. 打开纤维光度法设备，并用75%乙醇清洁跳线末端和陶瓷插头，以去除灰尘，避免因污垢导致的记录不良。
32. 使用光学功率计（Sanwa）测量470和405光在黑暗环境中的强度，确保它们均为20毫瓦/平方毫米。
33. 随后，对小鼠施加厌恶刺激（图3B），并使用商业纤维光度法设备（RWD）记录Ca²⁺信号。
注意：为了最小化周围环境的影响，钙成像在约110勒克斯光照的木制隔音箱内进行。a. 不同刺激之间至少要有5分钟的恢复期。b. 手动应用背部刷拭，并使用手动TTL脉冲发生器记录实验时间戳。c. 通过脉冲发生器（Inper Co., Ltd）自动生成空气喷射、音调和尾部电击刺激的时间戳。d. 通过在记录期间指定的时间施加刺激，将所有刺激与钙记录同步。
34. 白噪声刺激。
注意：通过扬声器（Momoho）向小鼠提供80分贝白噪声刺激（1秒），间隔30秒，总共10次刺激（图3C）。
35. 空气喷射刺激。
注意：通过连接到小型便携式空气压缩机（Daertuo）的塑料管向小鼠的一侧眼睛周围提供10次空气喷射（15磅/平方英寸）（图3D）。
36. 刷拭小鼠背部。
注意：给每只小鼠进行10次背部刷拭（每次持续2秒，刺激间隔30秒）（图3E）。
37. 尾部电击刺激。
注意：a. 将电极垫连接到电击器。b. 将电极垫放置在小鼠的尾部，正负垫之间的距离约为1厘米。c. 对每只小鼠施加10次尾部电击，强度为0.5毫安，每次持续2秒，间隔30秒（图3F）。
八、数据分析
使用470纳米LED（光纤尖端20微瓦）刺激表达GCaMP6m的细胞，以获得钙依赖性荧光信号；使用405纳米LED（光纤尖端20微瓦）刺激以获得钙独立信号（如运动）。使用405纳米光刺激获得的荧光信号校正运动伪影如下。
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